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PCR实验室在操作时应注意事项发布时间:2018-7-20

PCR(基因扩增实验室)检测微量感染因子时,操作人员容易因为污染而导致各种问题。SLD中检实验室技术根据多年行业经验,给出的建议是:进行PCR操作时,操作人员一定要严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现

PCR(基因扩增实验室)检测微量感染因子时,操作人员容易因为污染而导致各种问题。我们实验室技术根据多年行业经验,给出的建议是:进行PCR操作时,操作人员一定要严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染事故的发生。


一、PCR实验室划分操作区:


目前,对于普通PCR,业内还无法做到单人单管和实现完全封闭管理操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的物理区域内进行,PCR的前处理和后处理一定要设计在不同的隔离区内进行:


1、标本处理区,包括:扩增摸板制备;


2、PCR扩增区,包括:反应液的配制和PCR基因扩增;


3、产物分析区,包括:凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆制备。


各工作区要具有一定的隔离,操作器材要专用,而且要有一定方向性,如,标本制备→PCR扩增→产物分析→④产物处理。切记:产物分析区的产物及器材严禁拿到前后两个工作区,避免交叉污染。


二、PCR实验室试剂分装要求:


PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的负压工作台或超净工作台进行配制和分装,所有的吸头和加样器都需固定放于其中,吸头不能用来吸取扩增后的DNA和其它来源DNA:


1、PCR用水应为高压的双蒸水;


2、引物和d-NTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;


3、引物和d-NTP应分装储存,分装时应标明分装时间,以备发生污染时及时查找原因和追溯污染源头;


三、PCR扩增重要标准


1、PCR实验灵敏度


PCR实验灵敏度:是指PCR扩增反应能够检测到目的基因的最小值。


研究结果表明,影响PCR扩增效率的因素,有模板的完整性、反应温度、复杂程度、引物纯度及其与模板结合效率、DNA聚合酶的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成(主要指:阳离子)、反应优化剂等,这些因素都显著影响PCR实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下,常规PCR反应能够检测到pg(10~12g)数量级目的基因。对于一个特定的目的基因,模板与引物通常都是已经限定好的因素。因此,选择什么样的PCR反应体系(包括DNA聚合酶与反应缓冲液等)就是研究者提高PCR实验灵敏度的关键因素了。


2、PCR实验特异性


PCR实验特异性:是指在PCR扩增过程中,专一性扩增目的片段而非其他片段的性能。


在PCR实验本身的灵敏度很高,且实验条件未充分优化的情况下,通常会在目的片段出现同时伴随有其它杂带,即发生非特异性扩增现象。模板、引物性质及质量、反应条件控制等均会影响PCR扩增特异性。近年来的研究结果表明,缓冲液品质(如反应优化剂、离子种类与组成等)对保证PCR特异性扩增起着重要作用。


3、PCR灵敏性和特异性关联


PCR实验灵敏度与特异性是一对此长彼消特性,这也决定我们实验体系调节实际上就是需要找到适合实验灵敏度与特异性的平衡点。由于PCR体系中的成分众多,使得组合较多,筛选工作也就相对繁杂。


四、PCR实验操作注意事项:


尽管PCR扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应导致的,但样品间的交叉污染也是常见原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应时要谨慎对待,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应谨慎操作,一般需做到以下几点:


1、戴一次性手套,若不小心溅上反应液,应立即更换手套;


2、避免反应液飞溅,若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;


3、使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免空气中气溶胶的污染;


4、操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后再分装,这样既可以减少操作次数,避免污染,又可以增加反应的精确度;


5、最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;


6、操作时设立空白对照和阴阳性对照,既可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;


7、由于实际操作时加样器很容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,所以操作者最好使用高压处理过的或可替换的加样器。假如没有这种特殊的加样器,至少在PCR操作过程中加样器应该专用,严禁交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个相邻区域使用;


8、重复实验,验证结果,慎下结论。


五、综述:


由于PCR实验操作非常专业,在设计PCR基因扩增实验室时设计师也要充分考虑上述技术要求,避免PCR实验室在后续使用时出现返工、返修问题。

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